La prima apparizione di Quinto fu nella mini serie televisiva The Others. Frequentemente appare come guest star in telefilm statunitensi come CSI - Scena del crimine, Il tocco di un angelo, Streghe, Six Feet Under, Joan of Arcadia e Lizzie McGuire.

Nel 2004 è apparso nella terza stagione di 24 nel ruolo di un esperto di computer, Adam Kaufman. È apparso in tutti gli episodi meno che uno. Nel 2006 Quinto ha interpretato il ruolo di Sasan nel telefilm So Notorious e successivamente ha firmato un contratto per recitare nella serie televisiva della NBC, Heroes nel ruolo del serial killer Gabriel "Sylar" Gray.

Nel 2007 è stato inserito dalla rivista People tra gli uomini viventi più sexy del pianeta. Il 23 luglio dello stesso anno è stato scritturato nel ruolo del giovane Spock nell'undicesima pellicola di Star Trek.

Durante un'intervista del 2009 J.J. Abrams disse su Quinto: "Zachary rompe la gravità e ha un grandissimo senso dell'umorismo, questa è una fantastica combinazione, perché il carattere di Spock è decisamente complicato. La rivelazione l'ho avuta guardando il film, quando vedo quella sequenza di inquadrature, capisco quanto lui sia straordinario".

Nel 2008 in collaborazione con amici di lunga data, Corey Moosa e Neal Dodson, si forma un'impresa multimediale la "Before The Door Pictures". La BTD propone una vasta lista di progetti sviluppati nel cinema, televisione, web e graphic novel. La BTD ha prodotto il film Margin Call, presentato in anteprima al Sundance Film Festival 2011 e alla 61ª edizione del Festival di Berlino.

Nel 2011 inizia a collaborare con Ryan Murphy nella serie American Horror Story. Recita nella prima stagione, nella quale interpreta Chad, un ex proprietario della casa in cui si svolge la trama principale, tuttavia ha un ruolo comunque marginale; nella seconda stagione, invece, è il dottor Oliver Thredson, uno dei personaggi principali. Per la sua interpretazione del dottor Thredson riceve una nomination agli Emmy come miglior attore non protagonista e conquista una vittoria ai Critics' Choice Television Award nella medesima categoria.

Nel 2018 è protagonista a Broadway del musical The Boys in the Band, in scena al Booth Theatre dal 28 aprile all'11 agosto. Prodotta da Ryan Murphy, questo allestimento celebra il cinquantesimo anniversario di The Boys in the Band e il cast comprende Jim Parsons (Michael), Andrew Rannells (Larry), Charlie Carver (Cowboy), Tuc Watkins (Hank) e Matt Bomer (Donald) con la regia di Joe Mantello.