Nel 1993 appare per la prima volta sul grande schermo nel film di Woody Allen Misterioso omicidio a Manhattan, nel ruolo del figlio di Allen e Diane Keaton; la sua parte prevedeva un paio di battute, ma in sede di montaggio furono ridotte al minimo. Nel 1994 ottiene il ruolo principale del film per la televisione My Summer As a Girl prodotto dalla CBS, nel quale interpreta un ragazzo che si finge una ragazza per ottenere un lavoretto estivo.

Nel 1997, mentre è ancora uno studente alla scuola di cinema, gira il cortometraggio di 20 minuti Lionel on a Sunday, presentato a diversi festival. L'anno seguente si dedica anche al teatro, ottenendo delle piccole parti in alcune rappresentazioni teatrali di opere di William Shakespeare del Public Theater di New York, tra i quali il Macbeth, nel quale recita al fianco di star come Alec Baldwin e Angela Bassett e Romeo e Giulietta, nel quale ottiene il ruolo del protagonista. Nel 1999 ha ancora un ruolo in Getting to Know You - Cominciando a conoscerti, film indipendente, nel quale interpreta il fratello protettivo di Heather Matarazzo.

Nel 2000 ottiene il primo ruolo di rilievo nel film Il club dei cuori infranti, che vede protagonisti un gruppo di ragazzi gay di West Hollywood, nel quale Braff interpreta Benji, il più giovane membro del gruppo.

Nel 2001 arriva il successo e la notorietà  internazionale grazie alla serie televisiva  Scrubs - Medici ai primi ferri, prodotta dalla NBC, nella quale interpreta J.D., il protagonista della serie. Per la sua interpretazione ha ricevuto 3 candidature come miglior attore al Golden Globe e una agli Emmy Awards.

La consacrazione cinematografica arriva grazie a La mia vita a Garden State (2004), opera prima come regista e sceneggiatore, che Braff interpreta anche, al fianco di Natalie Portman, Ian Holm e Peter Sarsgaard. La pellicola è stata girata in gran parte nel suo stato d'origine, il New Jersey (soprannominato Garden State, letteralmente "stato giardino", per i suoi ampi spazi verdi), in diverse cittadine, come la natia South Orange, Maplewood e Tenafly. Nel febbraio 2005 vince Grammy Award per la colonna sonora di La mia vita a Garden State, da lui stesso assemblata e prodotta.

Sempre nel 2005 doppia il protagonista del primo film d'animazione in 3D della Disney, Chicken Little - Amici per le penne, e cura la regia del video musicale della canzone Chariot di Gavin DeGraw, nel quale appare Donald Faison, interprete nella serie televisiva Scrubs.

Il suo film successivo è The Last Kiss (2006) di Tony Goldwyn, remake statunitense de L'ultimo bacio di Gabriele Muccino, nel quale interpreta il ruolo del protagonista accanto a Rachel Bilson.

Nel 2013 prende parte al cast del film campione d'incassi Il grande e potente Oz come attore e doppiatore. Il 24 aprile 2013 Braff ha iniziato una campagna con il sito Kickstarter per finanziare il suo nuovo film Wish I Was Here, basato sulla sceneggiatura scritta con il fratello Adam. Nel 2015 dirige i premi Oscar Morgan Freeman, Michael Caine ed Alan Arkin in Insospettabili sospetti, uscito nelle sale americane il 16 dicembre 2016.